Duloksetyna w keratopatii związanej z aniridią – badanie na modelu mysim

Czy duloksetyna może cofnąć keratopatię w aniridii u dorosłych?

Wrodzona aniridia to rzadkie schorzenie oka wywołane głównie mutacjami genu PAX6, prowadzące do niepełnego rozwoju oka i licznych nieprawidłowości, takich jak hipoplazja tęczówki i dołka centralnego, jaskra wczesnego początku oraz zaćma. Najgroźniejszym powikłaniem jest jednak keratopatia związana z aniridią (AAK) – postępujące pogorszenie rogówki charakteryzujące się niedoborem komórek macierzystych limbusa, zapaleniem, neowaskularyzacją i utratą przejrzystości rogówki. AAK nasila się z wiekiem, a mimo interwencji chirurgicznych często prowadzi do ślepoty z powodu nieuniknionego odrzutu immunologicznego przeszczepionych komórek lub tkanek allogenicznych.

Niedawno przeprowadzono głęboką fenotypizację nowego modelu mysiego AAK – heterozygotycznej myszy Pax6^+/− small eye (Sey) na tle 129S1/SvImJ, która niesie kanoniczną mutację nonsensowną c.622G>T w genie Pax6, prowadzącą do przedwczesnego kodonu stop i skrócenia białka p.Gly208*. Model ten wiernie odzwierciedla powolny początek i progresję ludzkiego AAK, zapewniając zdefiniowane okno czasowe do oceny potencjalnych farmakoterapii adresujących niedobór PAX6.

Duloksetyna to selektywny inhibitor wychwytu zwrotnego serotoniny i norepinefryny (SSNRI), zatwierdzony przez FDA i powszechnie przepisywany doustnie w leczeniu depresji, zaburzeń lękowych, fibromialgii i bólu neuropatycznego. Niedawno wykazano, że duloksetyna skutecznie przywracała ekspresję endogennego genu PAX6 w komórkach nabłonka limbusa z mutacją nonsensowną in vitro. Dodatkowo krótkoterminowe leczenie duloksetyną zmieniało ekspresję PAX6 w pierwotnych ludzkich komórkach zrębowych limbusa od pacjentów z aniridią oraz wykazywało działanie przeciwzapalne w modelach in vitro i in vivo zapalenia wywołanego lipopolisacharydem.

Dlaczego warto było zbadać duloksetynę w modelu AAK?

Rozpoznając potrzebę identyfikacji nowych celów molekularnych i opracowania ukierunkowanych podejść terapeutycznych dla AAK – stanu, w którym procesy zapalne odgrywają istotną rolę – niniejsze badanie miało na celu przede wszystkim identyfikację zaburzonych transkryptów i szlaków w modelu mysim naśladującym rozwój ludzkiego AAK. Dodatkowo, biorąc pod uwagę obiecujące dowody in vitro i in vivo wspierające potencjalne efekty terapeutyczne duloksetyny oraz fakt, że większość pacjentów wymagających skutecznej terapii to dorośli z zaawansowanymi stadiami AAK, badacze chcieli ocenić, czy podawanie duloksetyny może przywrócić przejrzystość rogówki po ustanowieniu się postępującego AAK w tym modelu mysim.

Jak przeprowadzono eksperyment z duloksetyną?

W badaniu wykorzystano 27 myszy: 17 heterozygotycznych Pax6^+/− (Het) i 10 typu dzikiego (Wt), w wieku czterech miesięcy. Fenotypy rogówek u myszy Het wahały się od wczesnego stadium AAK (stopnie 1-2, 22 oczy) do późnego stadium AAK (stopnie 3-4, 12 oczu) na początku eksperymentu, zgodnie z wcześniej opublikowaną skalą gradacji AAK.

Przygotowano preparat w postaci kropli do oczu o stężeniu 10 μM duloksetyny (sól chlorowodorku), w lepkiej formulacji zawierającej 0,75% hydroksypropylocelulozę, 1% Tween 80, 0,9% NaCl o pH=7,0. Dziewięć myszy Het z 11 oczami w stadium wczesnym AAK i 7 oczami w stadium późnym otrzymywało duloksetynę (Het-dul), a osiem myszy Het z 11 oczami w stadium wczesnym i 5 oczami w stadium późnym otrzymywało tylko nośnik (Het-veh). Schemat podawania: dwa razy dziennie do obu oczu przez 90 dni. Myszy Wt pozostawiono nietknięte jako kontrole.

Charakteryzację fenotypu rogówki i gradację AAK przeprowadzono przed i po leczeniu, w wieku czterech miesięcy (początek eksperymentu) i siedmiu miesięcy (koniec eksperymentu), używając fotografii w lampie szczelinowej i obrazowania mikroskopii konfokalnej in vivo (IVCM) warstw rogówki. Po zakończeniu eksperymentu myszy poddano eutanazji w celu ekstrakcji tkanek.

Przeprowadzono kompleksową analizę obejmującą: immunofluorescencję (PAX6, P63, GPHA2, Ki-67, MUC5AC, CD31, LYVE-1), Western blot dla PAX6, oraz analizę transkryptomiczną całego genomu przy użyciu mikromacierzy GeneChip WT Plus w systemie MO 2.0. Analiza bioinformatyczna została przeprowadzona z wykorzystaniem narzędzi TAC, STRING, iPathwayGuide oraz DAVID.

Jakie zmiany molekularne wykryto w AAK?

Analiza transkryptomiczna całego genomu zidentyfikowała 365 genów różnicowo ekspresjonowanych (DEG) w rogówkach Het-Veh względem Wt (p<0,05, zmiana >1,8×). Wśród nich 181 genów było obniżonych, a 184 podwyższonych w Het.

Chrnb3 i Epgn były najbardziej znacząco obniżonymi genami ze zmianą odpowiednio −5,33× i −3,92×, oba będące komponentami szlaku sygnalizacji receptorów powierzchniowych komórki. Klk10 był najbardziej znacząco podwyższonym genem ze wzrostem 6,75-krotnym, a Cnfn, zaangażowany w różnicowanie komórek naskórka, wykazywał wzrost 4,5-krotny.

Analiza wzbogacenia szlaków ujawniła znaczące zmiany w specyficznych szlakach biologicznych u myszy Het względem Wt. Wśród nich szlak aktywacji dopełniacza klasycznego był znacząco wzbogacony (p=0,01), charakteryzujący się podwyższeniem czynników C2 i C4b. Dodatkowo szlak glukuronidacji był wzbogacony u myszy Het-Veh (p=0,01), z dwoma członkami rodziny Ugt2a (Ugt2a1 i Ugt2a2) będącymi obniżonymi.

Analiza procesów biologicznych przy użyciu platformy STRING ujawniła 110 terminów ontologii genowej (GO) będących znacząco wzbogaconych (FDR<0,05). Wszystkie wzbogacone procesy GO pogrupowano w sześć głównych kategorii: zapalenie, adhezja komórkowa, różnicowanie, ruchliwość komórek, keratynizacja i metabolizm leków. Analiza wykazała, że zapalenie, adhezja komórkowa, różnicowanie, ruchliwość komórek i keratynizacja były podwyższone w rogówkach myszy Het, podczas gdy metabolizm leków był obniżony względem myszy Wt.

Co istotne, rodzina Ccl21, obejmująca chemokiny związane z limfangiogenezą, była centralna i szeroko zaangażowana w zidentyfikowane terminy GO. Chemokina CCL21 jest głównie zaangażowana w kierowanie migracją komórek odpornościowych i została powiązana z limfangiogenezą poprzez zwiększanie ekspresji i wydzielania czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego-C (VEGF-C), kluczowego czynnika limfangiogennego.

Czy duloksetyna cofnęła zmiany w rogówce?

Obserwacje w lampie szczelinowej i IVCM potwierdziły, że zarówno w grupach Het-dul, jak i Het-veh, oczy z późnym stadium AAK pozostały w późnym stadium po leczeniu, podczas gdy oczy z wczesnym stadium AAK pozostały we wczesnym stadium po leczeniu. Późne stadium AAK charakteryzowało się inwazją naczyń krwionośnych do centralnej rogówki, podczas gdy IVCM ujawniło, że naczynia limfatyczne były obecne zarówno we wczesnym, jak i późnym stadium AAK.

W grupie leczonej duloksetyną porównanie stopnia AAK przed i po leczeniu nie wykryło znaczącej różnicy (brak regresji lub progresji, p=0,21). W grupie leczonej nośnikiem podobnie nie było zmiany w stopniu AAK przed i po leczeniu (p=0,16), wskazując, że stopień AAK był generalnie ustalony do czwartego miesiąca życia i nie zmieniał się później. Zmiana w stopniu AAK po 90 dniach leczenia nie była znacząco różna między grupami leczonymi duloksetyną lub nośnikiem (p>0,9).

Barwienie H&E i analiza ilościowa rogówek od myszy Wt i Het ujawniły, że leczenie duloksetyną nie doprowadziło do żadnej obserwowalnej poprawy w organizacji komórkowej nabłonka ani liczbie warstw nabłonkowych u myszy Het w porównaniu do tych leczonych nośnikiem. Nie można było wykryć błony podstawnej nabłonka w rogówkach od myszy Het, niezależnie od leczenia.

Podobnie barwienie immunofluorescencyjne dla PAX6 ujawniło brak zmiany w ekspresji u myszy Het leczonych 10 μM duloksetyny względem grupy leczonej nośnikiem, z PAX6 ograniczonym do warstwy podstawnej nabłonka u myszy Het, ale obecnym w całym nabłonku u myszy Wt. Ponadto analizy immunohistochemiczne P63 i GPHA2, kluczowych markerów populacji komórek macierzystych limbusa, wykazały, że duloksetyna nie zdołała zwiększyć ekspresji tych markerów komórek macierzystych u myszy Het.

Ekspresja Ki-67 wskazywała na aktywny i proliferacyjny nabłonek u myszy Het (ale nie u Wt), który nie został naprawiony przez duloksetynę. Dodatkowo ekspresja MUC5AC, markera koniunktywalizacji, była obecna w nabłonku zarówno grup leczonych duloksetyną, jak i nośnikiem, jednak w rogówkach leczonych duloksetyną ekspresja przesunęła się z warstwy podstawnej do bardziej powierzchownych warstw nabłonka.

Jakie zmiany molekularne wywołała duloksetyna?

Porównując Het-Dul z Het-veh, 253 geny były różnicowo ekspresjonowane (p<0,05, zmiana >1,4×). Wśród nich 20% było obniżonych, a 80% podwyższonych przez leczenie duloksetyną. Crisp1 i Ltf były najbardziej znacząco podwyższonymi genami, ze wzrostem odpowiednio 4,45× i 3,86×. Z kolei Ankrd34c i Igkv5-43 były najbardziej znacząco obniżonymi genami, ze zmianą odpowiednio −4,28× i −2,33×.

Na poziomie szlaków leczenie duloksetyną indukowało znaczące wzbogacenie w kaskadzie krzepnięcia krwi (p=0,0098), krytycznym szlaku dla hemostazy i gojenia ran, a także “metaszlaku biotransformacji” (p=0,024) i utleniania przez enzymy cytochromu P450 (p=0,036). Te dwa ostatnie szlaki są kluczowe w metabolizmie ksenobiotyków, wskazując na potencjalny wpływ duloksetyny na procesy metaboliczne i detoksykacyjne.

Kompleksowa analiza wzbogacenia szlaków i funkcji przeprowadzona przy użyciu iPathway zidentyfikowała cztery znaczące (FDR<0,05) i biologicznie znaczące procesy. Analiza ujawniła, że negatywna regulacja procesu wielokomórkowego organizmu była negatywnie regulowana, podczas gdy odpowiedź układu odpornościowego, proces rozwoju komórkowego i różnicowanie komórek były pozytywnie regulowane.

Z analizy szlaku KEGG “Spliceosom” był wzbogacony w rogówkach leczonych duloksetyną. Analiza transkryptomiczna ujawniła, że leczenie duloksetyną indukowało wyraźny profil ekspresji genów w rogówce, charakteryzujący się obniżeniem genów związanych z odpornością, w tym Igkv5-43 mającego rolę w odpowiedzi odpornościowej adaptacyjnej i Napepld zaangażowanego w regulację zapalenia i bólu, oraz podwyższeniem genów przeciwzapalnych i ochronnych, jak Ltf i Retnla.

Laktoferyna (Ltf) na przykład utrzymuje zdrowie rogówki poprzez swoje właściwości przeciwdrobnoustrojowe i przeciwzapalne. Zaburzone DEG przez duloksetynę głównie tłumiły odpowiedzi związane z odpornością, potencjalnie prowadząc do efektów przeciwzapalnych w rogówce, co jest zgodne z wcześniej zgłaszanymi efektami przeciwzapalnymi duloksetyny.

Czy duloksetyna zwiększyła ekspresję PAX6?

Biorąc pod uwagę centralną rolę PAX6 w keratopatii związanej z aniridią (AAK), przeprowadzono zarówno analizę Western blot, jak i ocenę transkryptomiczną w celu oceny wpływu leczenia duloksetyną na ekspresję PAX6. Jednak ani poziomy białka, ani poziomy transkryptu PAX6 w tkance rogówki nie były znacząco różne między grupami leczenia po 90-dniowym leczeniu. Te ustalenia wskazują, że zastosowany schemat duloksetyny nie był w stanie naprawić lub zwiększyć ekspresji PAX6 u leczonych myszy.

Co istotne, analiza ujawniła szeroką zaburzenie we wszystkich trzech fazach metabolizmu leków w rogówkach myszy Het. Konkretnie geny rodziny Cyp zaangażowane w fazę I (utlenianie przez enzymy cytochromu P450) były znacząco zaburzone, podczas gdy procesy fazy II (koniugacja przez UDP-glukuronylotransferazy lub UGT, i transferazy glutationowe alfa lub geny Gsta) i fazy III (wydalanie przez transportery ABC i białka rybosomu mitochondrialnego) były obniżone.

To sugeruje upośledzoną detoksykację, metaboliczne przetwarzanie ksenobiotyków i integralność błony komórkowej, a także upośledzoną obronę komórkową przed stresem oksydacyjnym u myszy Het; jednak leczenie duloksetyną wydawało się częściowo przywracać tę nierównowagę metaboliczną. Warto zauważyć, że duloksetyna modulowała kluczowe enzymy w metaszlaku biotransformacji, szlakach utleniania cytochromu P450 i Mgst1 (mikrosomalny Gst1) centralnych dla detoksykacji, metabolizmu cząsteczek bioaktywnych i kontroli zapalenia w rogówce.

Co oznaczają te wyniki dla przyszłych terapii AAK?

Duloksetyna, podawana przy użyciu obecnego schematu i metody dostarczania, nie była w stanie zwiększyć ekspresji PAX6 na poziomie transkryptomicznym lub białkowym w rogówce, ani naprawić ustalonego AAK. Wiek myszy w tym badaniu odpowiada ludziom starszym niż 40-50 lat, podczas gdy zauważono, że w badaniach ludzkich potencjalne okno dla leczenia istnieje preferencyjnie w dzieciństwie. Jednak niedawna seria przypadków Avila i współpracowników donosiła o sześciu pacjentach z aniridią, którzy otrzymywali wysokie stężenie 6 mM duloksetyny jako krople do oczu przez okres 12 miesięcy. Chociaż klinicznie oczywiste zmniejszenie keratynizacji rogówki obserwowano w niektórych przypadkach, skuteczność leczenia była zmienna. Wyższe stężenia leków mogą być potrzebne, a także leczenie przez przedłużony okres. Nasze wyniki również motywują potrzebę dalszych badań u młodszych myszy, idealnie inicjując leczenie podczas wczesnych etapów poporodowych po otwarciu powiek do wieku początkowego 1 miesiąca, kiedy procesy związane z chorobą nie są jeszcze w pełni ustalone. Mimo tego analiza transkryptomiczna wskazała na liczne efekty przeciwzapalne i modulujące odpowiedź immunologiczną duloksetyny jako farmakoterapii miejscowej w rogówce, a wyniki przedstawione tutaj stanowią cenną informację dla przyszłych badań i innych stanów.