Duloksetyna i ritanserin w terapii aniridii – wyniki badań klinicznych

Jakie wyzwania stoją przed terapią aniridii?

Badanie kohortowe z udziałem pacjentów z wrodzoną aniridią oceniło skuteczność duloksetyny i ritanserinu w zwiększaniu ekspresji genu PAX6, którego haploinsuficjencj a jest główną przyczyną tej rzadkiej choroby oka. Aniridia prowadzi do rozwoju keratopatii związanej z aniridią (AAK), charakteryzującej się postępującym zmętnieniem rogówki i znacznym upośledzeniem widzenia.

Badanie objęło 11 pacjentów z aniridią o zróżnicowanym stopniu nasilenia AAK (stopnie 3-5) oraz 21 zdrowych dawców. Pacjenci z aniridią mieli różnorodne mutacje w genie PAX6, w tym mutacje nonsensowne, delecje, mutacje w miejscach splicingowych i przedłużenia C-końcowe. Od uczestników pobrano biopsje rąbkowe, z których izolowano pierwotne komórki nabłonka rąbkowego (pLECs). W celu modelowania anirydii in vitro zastosowano również wyciszenie genu PAX6 za pomocą siRNA w komórkach od zdrowych dawców, co miało symulować haploinsuficjencję PAX6 charakterystyczną dla tej choroby.

Czy leki repurposeowane mogą zwiększyć ekspresję PAX6?

Komórki poddano działaniu duloksetyny (inhibitor wychwytu zwrotnego serotoniny i noradrenaliny) oraz ritanserinu (antagonista receptora 5-HT₂), które w poprzednich badaniach na liniach komórkowych wykazywały zdolność do zwiększania ekspresji PAX6. Żywotność komórek po ekspozycji na różne stężenia leków (1-5 μM) oceniono za pomocą testu XTT, nie stwierdzając istotnego wpływu na przeżywalność komórek przy żadnym z badanych stężeń (p ≥ 0,01 dla duloksetyny i p ≥ 0,08 dla ritanserinu).

Analiza ekspresji PAX6 za pomocą RT-qPCR wykazała, że ani duloksetyna, ani ritanserin w stężeniu 5 μM nie zwiększały istotnie ekspresji mRNA PAX6 w komórkach z wyciszonym genem PAX6 (p = 0,9 dla duloksetyny i p = 0,7 dla ritanserinu) ani w komórkach pacjentów z aniridią, niezależnie od stopnia zaawansowania AAK. Podobne wyniki uzyskano przy analizie ekspresji białka PAX6 metodą Western blot (p ≥ 0,8). Aby wykluczyć możliwość, że brak efektu leków wynikał z wysokiego stężenia siRNA, przeprowadzono również eksperymenty z niższym stężeniem siRNA (2,5 nM zamiast 5 nM), ale wyniki pozostały niezmienione (p ≥ 0,8).

Szczegółowa analiza izoform PAX6 (PAX6-5 i PAX6-5a) wykazała, że po wyciszeniu genu PAX6 za pomocą siRNA, poziom izoformy PAX6-5 uległ istotnemu obniżeniu (p = 0,04), podczas gdy spadek poziomu izoformy PAX6-5a nie osiągnął istotności statystycznej (p = 0,07). Jednak nawet przy tej różnicy w odpowiedzi izoform, leczenie duloksetyną i ritanserinem nie spowodowało istotnego wzrostu ekspresji żadnej z izoform (p ≥ 0,1).

Interesującym odkryciem było zaobserwowanie, że duloksetyna istotnie zmniejszała ekspresję fosforylowanego ERK (pERK) w komórkach pLECs (p = 0,01), co sugeruje hamowanie szlaku MAPK. Wcześniejsze badania wskazywały, że inhibitory szlaku MEK/ERK mogą pośrednio zwiększać ekspresję PAX6. Jednak w tym przypadku redukcja pERK nie przełożyła się na wzrost ekspresji PAX6 (p = 0,9). Ritanserin nie miał istotnego wpływu na poziom pERK (p = 0,6) ani na ekspresję PAX6 (p = 0,8). Całkowity poziom ERK1/2 pozostał niezmieniony we wszystkich grupach (p ≥ 0,4).

Badanie obejmowało również analizę ekspresji genów docelowych PAX6, w tym genów związanych z metabolizmem retinolu i kwasów tłuszczowych (ADH7, ALDH1A1, FABP5), białek połączeń międzykomórkowych (DSG1), keratyn (KRT3, KRT12), inhibitora proteazy SPINK7 oraz markera komórek macierzystych ABCG2. Żaden z tych genów nie wykazał istotnych zmian ekspresji po leczeniu duloksetyną lub ritanserinem (p ≥ 0,2 dla genów metabolizmu, p ≥ 0,6 dla keratyn i białek połączeń, p = 0,8 dla ABCG2).

Jak wpływa heterogenność na wyniki badań?

Wyniki badania kontrastują z wcześniejszymi doniesieniami o skuteczności duloksetyny i ritanserinu w zwiększaniu ekspresji PAX6 w zmodyfikowanych liniach komórkowych (mut-LSCs) uzyskanych przy użyciu technologii CRISPR/Cas9. Autorzy sugerują, że różnice te mogą wynikać z odmiennych warunków hodowli, heterogenności populacji komórek pierwotnych oraz zróżnicowanego statusu różnicowania tych komórek. Komórki pierwotne użyte w badaniu stanowią heterogeniczną populację o zróżnicowanej ekspresji PAX6, podczas gdy linie immortalizowane użyte w poprzednich badaniach wykazywały bardzo niski poziom markerów różnicowania rogówkowego, co wskazuje na ich bliższe podobieństwo do fenotypu komórek macierzystych.

Ważnym czynnikiem może być również heterogenność mutacji PAX6 u pacjentów z aniridią, co utrudnia jednoznaczną ocenę skuteczności terapii. Autorzy zwracają uwagę, że ekspresja mRNA PAX6 nie różniła się istotnie między zdrowymi a chorymi na aniridię komórkami pLECs w poprzednich badaniach, co może częściowo wyjaśniać brak odpowiedzi na leczenie.

Badanie to stanowi pierwszy raport o zastosowaniu repurposeowanych leków (duloksetyny i ritanserinu) na pierwotnych komórkach nabłonka rąbkowego pacjentów z aniridią. Wyniki wskazują na konieczność dalszych badań w różnych systemach hodowli oraz modelach in vivo w celu lepszej oceny skuteczności tych leków w leczeniu AAK związanej z aniridią.

Podsumowanie

Przeprowadzone badanie kohortowe z udziałem 11 pacjentów z aniridią i 21 zdrowych dawców miało na celu ocenę skuteczności duloksetyny i ritanserinu w zwiększaniu ekspresji genu PAX6. Analiza wykazała, że żaden z testowanych leków nie spowodował istotnego wzrostu ekspresji PAX6, zarówno na poziomie mRNA, jak i białka, niezależnie od stopnia zaawansowania choroby. Duloksetyna wykazała wpływ na szlak MAPK poprzez zmniejszenie ekspresji fosforylowanego ERK, jednak nie przełożyło się to na wzrost ekspresji PAX6. Badanie nie wykazało również istotnych zmian w ekspresji genów docelowych PAX6, w tym genów związanych z metabolizmem retinolu i kwasów tłuszczowych. Wyniki kontrastują z wcześniejszymi badaniami na liniach komórkowych, co może wynikać z heterogenności populacji komórek pierwotnych oraz różnorodności mutacji PAX6 u pacjentów z aniridią. Badanie podkreśla konieczność prowadzenia dalszych analiz w różnych systemach hodowli i modelach in vivo.