Duloksetyna hamuje STAT3 – nowy mechanizm przeciwbólowy

Czy duloksetyna wywiera podwójne działanie przeciwbólowe?

Badanie integracyjne przeprowadzone przez zespół naukowców ujawniło nowy mechanizm działania przeciwbólowego duloksetyny, inhibitora wychwytu zwrotnego serotoniny i noradrenaliny (SNRI). Badanie wykorzystywało zaawansowane techniki in silico (dokowanie molekularne, symulacje dynamiki molekularnej) w połączeniu z walidacją in vitro w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw efektów przeciwbólowych duloksetyny.

Badania przeprowadzono na modelach komórkowych C2C12 (mysie mioblasty), gdzie analizowano oddziaływanie duloksetyny z fosforylowaną formą białka STAT3 (pSTAT3). Jako punkt odniesienia wykorzystano ruksolitynib – znany inhibitor kinaz JAK1/2, który hamuje fosforylację STAT3. Badanie obejmowało analizy dokowania molekularnego, symulacje dynamiki molekularnej, obliczenia energii wiązania (MM-PBSA), testy żywotności komórek, analizy western blot oraz sekwencjonowanie RNA.

Jakie interakcje molekularne uzasadniają działanie duloksetyny?

Analizy dokowania molekularnego wykazały, że duloksetyna tworzy stabilne interakcje w kieszeni wiążącej pSTAT3, formując konwencjonalne wiązanie wodorowe z GLU204 oraz interakcje π-π z TYR176 i kilka kontaktów π-alkilowych (LEU179, LYS180, MET200, LEU203, LEU207). Energia wiązania duloksetyny z pSTAT3 wynosiła -5,83 kcal/mol, podczas gdy dla ruksolitinibu była nieco niższa (-6,19 kcal/mol), wskazując na jego silniejsze powinowactwo. Oba ligandy celują w nakładające się reszty aminokwasowe, jednak chemizm interakcji różni się – duloksetyna wprowadza więcej stabilizacji polarnej, podczas gdy ruksolitinib opiera się na silniejszych oddziaływaniach hydrofobowych i siarkowych.

W przypadku interakcji z nieufosforylowanym STAT3, duloksetyna angażowała głównie reszty LYS591, ARG609, SER636, PRO639, VAL637 i GLU638, tworząc jedno konwencjonalne wiązanie wodorowe z GLU638, a także interakcje π-kationowe, π-alkilowe i wiązania typu amidowego. Energia wiązania wynosiła -5,24 kcal/mol. Ruksolitinib natomiast wykazywał silniejsze interakcje polarne, tworząc konwencjonalne wiązania wodorowe z ILE634, ARG609 i LYS591 oraz wiązanie wodorowe z węglem z SER636 i GLU594. Energia wiązania ruksolitinibu z STAT3 wynosiła -6,06 kcal/mol, co wskazuje na jego silniejsze powinowactwo w porównaniu z duloksetyną.

Czy symulacje dynamiki molekularnej potwierdzają stabilność interakcji?

Symulacje dynamiki molekularnej potwierdziły, że kompleksy STAT3 i pSTAT3 z oboma ligandami osiągnęły równowagę podczas symulacji, przy czym kompleksy z ruksolitinibem wykazywały niższe odchylenia RMSD w porównaniu z kompleksami z duloksetyną, wskazując na bardziej stabilną konformację. Wartości SASA (powierzchni dostępnej dla rozpuszczalnika) pozostawały spójne dla obu białek, jednak formy związane z ruksolitinibem wykazywały nieco zmniejszoną ekspozycję na rozpuszczalnik. Analizy RMSF (fluktuacji średniokwadratowych) ujawniły, że wiązanie obu ligandów zmniejszyło lokalną elastyczność STAT3 i pSTAT3, przy czym ruksolitinib zapewniał silniejszą stabilizację.

Wartości promienia żyracji (Rg) dla wszystkich kompleksów były stabilne w zakresie ~3,35-3,45 nm. Kompleksy STAT3-ruksolitinib i pSTAT3-ruksolitinib konsekwentnie utrzymywały nieznacznie niższe wartości Rg, potwierdzając bardziej zwartą strukturę. Analiza wiązań wodorowych wykazała istotną różnicę: ruksolitinib tworzył większą liczbę trwałych wiązań wodorowych zarówno z STAT3, jak i pSTAT3 przez cały okres 10 ns trajektorii, podczas gdy interakcje duloksetyny były mniej liczne i bardziej przejściowe.

Jaki jest obraz energii wiązania w kompleksach STAT3?

Obliczenia MM-PBSA wykazały, że duloksetyna ma nieco korzystniejszą całkowitą energię wiązania z pSTAT3 (ΔG = -15,17 kJ·mol^-1) niż ruksolitinib (ΔG = -12,98 kJ·mol^-1). W obu przypadkach oddziaływania van der Waalsa były głównymi korzystnymi czynnikami (-20,29 i -26,27 kJ·mol^-1, odpowiednio). Ruksolitinib miał silniejszy składnik elektrostatyczny (ΔE_EL = -14,61 kJ·mol^-1 vs. -19,16 kJ·mol^-1 dla duloksetyny), ale ta przewaga była niwelowana przez większą niekorzystną energię solwatacji (ΔG_SOLV = +27,89 kJ·mol^-1).

W przeciwieństwie do tego, dla kompleksów STAT3, duloksetyna tworzyła niekorzystną energię wiązania (ΔG = +9,78 kJ·mol^-1), podczas gdy ruksolitinib utrzymywał słabe, ale korzystne wiązanie (ΔG = -6,39 kJ·mol^-1). Wyniki te sugerują, że oba ligandy wiążą się korzystniej z fosforylowaną formą STAT3 w porównaniu z nieufosforylowaną formą, przy czym duloksetyna wykazuje najbardziej stabilną interakcję spośród testowanych kompleksów.

Czy leczenie wpływa na żywotność komórek i ekspresję genów?

Badania na komórkach C2C12 wykazały, że duloksetyna w stężeniach 6,4 μM i 12,8 μM znacząco hamuje fosforylację STAT3 indukowaną przez IL-6, podobnie jak ruksolitinib, choć efekt tego drugiego był silniejszy. Test MTT wykazał, że przy najwyższym testowanym stężeniu (12,8 μM) komórki traktowane duloksetyną zachowywały 80-90% żywotności, podczas gdy komórki traktowane ruksolitinibem wykazywały obniżoną żywotność na poziomie 70-80% w porównaniu z niepoddanymi działaniu kontrolami. W niższych stężeniach (0,2-3,2 μM) oba leki powodowały minimalną cytotoksyczność.

Analiza transkryptomiczna wykazała, że ekspresja genu STAT3 (XLOC_008057; chr11:100777631-100861443) pozostawała na stałym poziomie we wszystkich warunkach leczenia, co wskazuje, że w działaniu ruksolitinibu i duloksetyny mogą być zaangażowane mechanizmy post-transkrypcyjne lub post-translacyjne, takie jak aktywacja zależna od fosforylacji, a nie modulacja transkrypcyjna STAT3.

Hierarchiczna analiza klastrowa i analiza map cieplnych różnicowo ekspresjonowanych transkryptów wykazała odrębne profile ekspresji genów po leczeniu IL6 w połączeniu z duloksetyną lub ruksolitinibem w dwóch różnych stężeniach (12,8 μM i 6,4 μM). Zaobserwowano dwa główne klastry genów. Pierwszy i większy klaster zawierał transkrypty, które były podwyższone (oznaczone kolorem pomarańczowo-czerwonym), a indukcja ta była spójna dla obu leków. Podwyższone geny obejmowały regulatory odpowiedzi na stres i sygnalizacji, takie jak Ndrg2, Enpp2, Madd, Ucp2, Robo1 i Rbbdl2. Drugi klaster zawierał mniejszą grupę transkryptów silnie obniżonych po leczeniu, szczególnie w komórkach eksponowanych na ruksolitinib. Reprezentatywne geny obniżone obejmowały Tle2, Adgrl1, Plekhg2, Col6a1, Shd i Scr.

Jak modulowane są izoformy STAT3 i proces splicingu?

Analiza map cieplnych izoform STAT3 ujawniła odrębne, zależne od dawki wzorce ekspresji w grupach leczenia. Kanoniczne izoformy wykazywały stosunkowo stabilną ekspresję zarówno przy leczeniu duloksetyną, jak i ruksolitinibem, wskazując, że podstawowa transkrypcja STAT3 pozostaje w dużej mierze niezmieniona. Natomiast kilka nowych izoform, oznaczonych kodem klasy “j”, wykazywało wyraźną regulację różnicową, podkreślając wpływ alternatywnego składania w odpowiedzi na interwencję farmakologiczną.

W przypadku duloksetyny, niższa dawka (6,4 μM) powodowała umiarkowane zmiany w ekspresji izoform, przy czym wybrane nowe izoformy wykazywały niewielką regulację w górę lub w dół. Przy wyższej dawce (12,8 μM) kilka nowych izoform było podwyższonych, co sugeruje, że zwiększona ekspozycja na lek promuje różnorodność transkryptów i selektywnie wzmacnia specyficzne warianty splicingowe. Podobnie ruksolitinib wykazywał zależną od dawki modulację izoform STAT3: przy dawce 6,4 μM wywoływał niewielkie zmiany w nowych izoformach, podczas gdy przy dawce 12,8 μM indukował silniejszą regulację różnicową, z pewnymi nowymi transkryptami znacznie podwyższonymi.

Jakie szlaki sygnalizacyjne są celowane przez leki?

Analizy splicingu dodatkowo wykazały odrębne efekty zależne od leczenia. W przypadku duloksetyny, modulacja splicingu była subtelna w regionie chr11:100780712-100784112. Próbki kontrolne wykazywały IncLevel 0,90, który nieznacznie zmniejszył się do 0,80 przy duloksetynie 6,4 μM, ale powrócił blisko wartości wyjściowej (0,86) przy duloksetynie 12,8 μM, co sugeruje łagodne i odwracalne efekty na wykorzystanie egzonu. W przypadku zdarzeń obejmujących chr11:100780712-100780754 i egzony downstream w chr11:100780304-100780366/416, próbki kontrolne wykazywały znaczne włączenie egzonu (IncLevel 0,85), podczas gdy ruksolitinib w stężeniu 6,4 μM skutkował całkowitym włączeniem (IncLevel 1,00), sugerując zwiększoną wierność splicingu.

Duloksetyna w stężeniu 6,4 μM była związana ze znaczącym wzbogaceniem szlaków związanych z aktywnością mitochondrialną, fosforylacją oksydacyjną i kontrolą jakości białek. Kategorie GO podkreślały zmiany w oddychaniu komórkowym i aktywności łańcucha transportu elektronów, podczas gdy szlaki KEGG podkreślały modulację interakcji ligand-receptor neuroaktywnych i sygnalizacji metabolicznej. Przy wyższym stężeniu 12,8 μM wpływ duloksetyny stał się bardziej rozległy, z wzbogaceniem procesów zaangażowanych w sygnalizację apoptotyczną, odpowiedź na niewłaściwie sfałdowane białka i regulację transkrypcyjną.

Ruksolitinib natomiast wykazywał odrębny wzorzec wzbogacenia zgodny z jego znanymi działaniami farmakologicznymi. Przy 6,4 μM wyraźnie wpływał na sygnalizację za pośrednictwem cytokin, regulację immunologiczną i procesy związane z JAK-STAT. Analiza KEGG dodatkowo podkreśliła znaczące zaangażowanie interakcji cytokinowych i sygnalizacji JAK-STAT. Zwiększenie dawki do 12,8 μM wzmocniło te efekty i rozszerzyło profil wzbogacenia o odpowiedzi zapalne, regulację apoptotyczną i kontrolę cyklu komórkowego.

Czy potwierdzono hamowanie STAT3 w badaniach western blot?

Badania western blot wykazały, że zarówno pSTAT3, jak i STAT3 uległy znacznemu obniżeniu po podaniu duloksetyny w stężeniu 12,8 μM (p < 0,0001), a chociaż znaczną supresję zaobserwowano również przy 6,4 μM (p < 0,0001), efekt był nieco mniejszy, co sugeruje hamowanie zależne od dawki. Podobnie leczenie ruksolitinibem w stężeniach 12,8 μM i 6,4 μM powodowało głębokie obniżenie ekspresji pSTAT3 i STAT3 (p < 0,0001). Co istotne, ruksolitinib wykazywał silniejszy efekt hamujący w porównaniu z duloksetyną w odpowiednich stężeniach, z najbardziej wyraźnym obniżeniem obserwowanym przy 12,8 μM.

Jakie są kliniczne implikacje wyników badań?

Badanie to dostarcza istotnych dowodów, że duloksetyna, oprócz klasycznego mechanizmu działania jako SNRI, wywiera pleiotropowy efekt poprzez bezpośrednie hamowanie sygnalizacji pSTAT3 i regulację różnorodności izoform STAT3. Ta podwójna funkcja może wyjaśniać jej skuteczność kliniczną w przewlekłych zespołach bólowych o komponentach zarówno neuropatycznych, jak i zapalnych. Duloksetyna wywiera swoje efekty poprzez wzajemnie połączone szlaki obejmujące neurotransmisję, metabolizm mitochondrialny i regulację odpowiedzi na stres, co może podkreślać jej trwałą skuteczność kliniczną w przewlekłych zespołach bólowych z komponentami zarówno neuropatycznymi, jak i zapalnymi.

Korzystna równowaga między skutecznością a żywotnością komórek sugeruje szersze okno terapeutyczne w porównaniu z selektywnymi inhibitorami JAK. Uzyskane wyniki mogą mieć istotne implikacje kliniczne dla lekarzy leczących pacjentów z przewlekłym bólem, szczególnie w przypadkach współistniejącej depresji lub u pacjentów w podeszłym wieku z chorobami towarzyszącymi. Dalsze badania powinny rozszerzyć walidację na neurony i komórki glejowe oraz modele in vivo przewlekłego bólu, aby w pełni potwierdzić translacyjne znaczenie odkrytych mechanizmów.

Podsumowanie

Badania przeprowadzone przez zespół naukowców ujawniły, że duloksetyna – lek znany przede wszystkim jako inhibitor wychwytu zwrotnego serotoniny i noradrenaliny – wykazuje dodatkowy, dotychczas nieznany mechanizm działania przeciwbólowego poprzez bezpośrednie hamowanie fosforylowanej formy białka STAT3. Wykorzystując zaawansowane techniki dokowania molekularnego, symulacje dynamiki molekularnej oraz walidację na modelach komórkowych C2C12, naukowcy wykazali, że duloksetyna tworzy stabilne interakcje w kieszeni wiążącej pSTAT3, formując wiązania wodorowe i inne interakcje molekularne z energią wiązania wynoszącą minus 5,83 kcal na mol. Symulacje potwierdziły stabilność tych kompleksów, przy czym duloksetyna wykazywała korzystniejszą całkowitą energię wiązania z pSTAT3 w porównaniu z ruksolitinibem, znanym inhibitorem kinaz JAK. Badania na komórkach wykazały, że duloksetyna w stężeniach 6,4 i 12,8 mikromolara skutecznie hamuje fosforylację STAT3 indukowaną przez interleukinę 6, zachowując przy tym wyższą żywotność komórek niż ruksolitinib. Analiza transkryptomiczna ujawniła, że oba leki modulują ekspresję genów związanych z odpowiedzią na stres i sygnalizacją, przy czym duloksetyna wpływa szczególnie na aktywność mitochondrialną i fosforylację oksydacyjną, podczas gdy ruksolitinib celuje głównie w szlaki sygnalizacyjne cytokin i JAK-STAT. Badania western blot potwierdziły znaczące, zależne od dawki obniżenie zarówno pSTAT3, jak i STAT3 po podaniu duloksetyny. Odkrycie tego podwójnego mechanizmu działania – zarówno poprzez modulację neurotransmisji, jak i hamowanie szlaku STAT3 – może wyjaśniać kliniczną skuteczność duloksetyny w leczeniu przewlekłych zespołów bólowych o komponentach neuropatycznych i zapalnych, szczególnie u pacjentów z współistniejącą depresją.